摘 要：试验采用胃蛋白酶-胰酶两步水解法，探讨非淀粉多糖（NSP）酶的组成及活性对特定蛋鸡日粮的黏度影响，从而筛选出对于特定组成蛋鸡日粮的最佳复合酶制剂配方，为针对特定地区日粮筛选优化NSP酶提供快捷有效的方法。试验以饲料黏度变化为检测指标，建立了NSP酶添加量与离体黏度的对应关系。结果表明：组合NSP酶作用效果显著优于单一NSP酶，日粮中NSP种类和含量决定了NSP酶的最佳酶谱和最适添加量。
关键词：体外消化；黏度；能量；复合酶制剂

近年来，在家禽日粮中使用非淀粉多糖（NSP）酶已非常普遍，但NSP酶的作用效果受诸多因素的影响，特别是酶谱的组成、活性与日粮中相应底物的匹配性。因此，针对日粮的抗营养特性筛选与之相适应的NSP酶，可以最大限度地利用饲料的有效能值。国内蛋鸡饲料配方多为玉米-豆粕-杂粕型，豆粕中含有30.3%的NSP（Smits和Annison，1996），其中70%~90%为细胞壁成分，细胞壁形式的NSP由溶解度、颗粒大小和化学结构各异的分子团组成。小肠内NSP的抗营养作用体现在产生的食糜黏度和抑制被包裹的养分降解上（Bedford，1999）。很多试验已经表明饲料酶可打开这些高聚物之间的连接而降低其在肠道中造成的黏度，提高饲料养分消化率。试验证明，黏度是预测酶制剂在肉鸡大麦日粮中效果的最佳指标（Rotter等，1989）。研究表明，外源性β-葡聚糖酶可以显著地提高饲喂大麦型和燕麦型日粮肉鸡的生产性能，而对黑麦型日粮的作用效果不明显，这说明两种日粮中酶作用的底物差异较大，大麦、燕麦中的NSP以β-葡聚糖为主，而小麦和黑麦中NSP主要为阿拉伯木聚糖（Friesen等，1992）。Choct等（1997）也发现，对小麦、黑麦、小黑麦、大麦、高粱、大米和玉米日粮，鸡日粮代谢能值（AME）与其中的阿拉伯木聚糖（R2=-0.95）及NSP（R2=-0.97）含量间存在着较强的负相关性。
现阶段酶制剂的应用技术尚不完善，其使用依然存在着随意性，很多试验停留在验证酶制剂的效果上，所得到的试验结果存在片面性，对复合酶使用效果的评价也存在很多争议，这些都制约着酶制剂的进一步推广应用。为了探讨复合NSP酶中酶谱的组成与活性同日粮潜在可利用能值的关系，本试验以胃蛋白酶-胰酶两步酶水解法为技术手段，以食糜黏度变化为检测指标，针对蛋鸡日粮中NSP的特性，筛选与之适应的酶谱，为NSP酶制剂使用者提供理论参考。

1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
pH计（PHS-3C）、紫外可见分光光度计（752N）、磁力搅拌器、鼓风干燥箱、恒温水浴振荡器、医用低速离心机（40C）、Brookfield黏度计（DV-Ⅱ+Pro型）、胃蛋白酶（1:2000，Sigma）、胰酶（Sigma）。
1.2 试验酶制剂
木聚糖酶（3.60吆⁷ U/g）、甘露聚糖酶（7.20吆⁶ U/g）、果胶酶（1.50吆⁶ U/g）。
木聚糖酶活性单位定义为在37℃和pH 5.5条件下，每分钟从1.0%燕麦木聚糖底物中释放1μg还原性产物所需要的酶量定义为一个木聚糖酶单位，以U/g表示。
甘露聚糖酶活性单位定义为在37℃和pH 5.5条件下，每分钟从0.6%甘露聚糖底物中释放1μg还原性产物所需要的酶量定义为一个甘露聚糖酶单位，以U/g表示。
果胶酶活性单位定义为在37℃和pH 5.5条件下，每分钟从0.8%果胶底物中释放1μg还原性产物所需要的酶量定义为一个果胶酶单位，以U/g表示。
1.3 试验设计
试验日粮中植物性原料的种类与含量见表1。日粮中木聚糖、甘露聚糖和果胶含量较高。试验首先在日粮中添加不同梯度木聚糖酶（4、5、6、7、8g/t），通过食糜黏度的变化得到木聚糖酶的适宜添加量；将木聚糖酶适宜添加量确定后，保持木聚糖酶添加量不变，再分别在日粮中添加不同剂量甘露聚糖酶（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/t）；同样的方法确定甘露聚糖酶最适添加量之后，保持木聚糖酶和甘露聚糖酶最适添加量不变，在日粮中添加不同剂量果胶酶（10、15、20、25、30g/t），通过食糜黏度的变化确定果胶酶的适宜添加量，最终得到蛋鸡日粮适宜复合酶制剂组合和活性的含量。

表1 蛋鸡日粮中植物性原料种类与含量 %

1.4 体外消化过程
根据Bedford和Classen（1993）的方法稍作修改。具体操作如下：准确称取1.25g粉碎（过1mm筛）饲料样品于三角瓶中，分别加入不同梯度外源酶制剂（木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶）后，再加入1mg/mL新鲜胃蛋白酶盐酸溶液（0.1N，pH=2.0），在40℃恒温水浴中振荡，消化时间为2h。胃消化阶段结束后，向溶液中加入1mL新鲜胰酶溶液（5mg/mL），调节溶液pH值为6.5（用1M NaOH溶液），于40℃恒温水浴中振荡，消化时间为4h。
1.5 检测指标
体外消化结束后将三角瓶取出，混合物于3 000g离心15min，取上清液用黏度计（Brookfield DV-Ⅱ+ Pro）测定其黏度。黏度变化（%）= 加酶组食糜黏度/对照组食糜黏度𴠼。

2 结果与讨论
2.1 胃蛋白酶-胰酶两步法体外模拟消化试验
随着饲用酶制剂应用越来越深入，准确科学地对饲用酶作用效果进行评估和预测显得十分重要。通常动物饲养试验是准确可靠的评定方法，但是由于酶谱筛选试验较复杂，试验组较多，因此，用动物饲养试验法筛选酶谱不仅费时、费力，而且试验结果变异性较大，不能对饲用酶制剂作出准确评估。体外模拟消化技术评定NSP酶的可行性和其在酶制剂应用研究中的作用已经由试验得到证明（Graham，1988；Bedford和Classen，1993）。随着技术进步和单胃动物消化生理的研究进展，单胃动物体外消化技术也得到了很大发展，其中应用最多的是胃蛋白酶-胰酶两步法，该方法所测得的猪体外养分消化率与体内消化率之间存在较强的相关性，可以用于预测多种饲料蛋白质、干物质、能量等养分的体内消化率。
外源酶制剂除了在饲料加工过程中有损失，还受到消化道内环境的影响（唐茂妍等，2009）。因而体外模拟消化技术通过模拟畜禽消化道内环境参数，可较好反映出外源酶制剂在畜禽消化道内催化反应的条件。有学者成功运用体外消化模拟技术分别对火鸡和猪日粮中添加外源酶制剂的作用效果进行了评定和预测（Zyla等，1995；Liu等，1997）。Bedford等（1993）利用离体法准确地预测了酶制剂对肉仔鸡小肠食糜黏度和增重的影响。Malathi和Devegowda（2001）利用离体法测定消化产物的黏度和总糖释放量进行了酶谱筛选。侯小锋等（2005）利用两步法准确地对添加酶制剂的肉仔鸡日粮生物学效价进行了评定，并获得了AME（Y，MJ/kg）与IVDE（X，MJ/kg）的回归方程：Y＝0.824 2X+2.365 4（r＝0.884 6）。以上诸多试验结果均证明了离体法在酶谱筛选工作中的可行性。
本试验采用胃蛋白酶-胰酶两步法体外模拟了消化道生理参数，包括pH值、消化液浓度、消化酶种类和浓度等条件。试验表明，随着木聚糖酶添加量增加饲料黏度逐渐降低。木聚糖酶添加量为6.0g/t时，饲料黏度最低，继续添加木聚糖酶饲料黏度下降不显著。与木聚糖酶相似，饲料黏度随甘露聚糖酶添加量的增加而显著降低，但其添加量达到一定程度时（1.5g/t），酶添加量再增加，饲料黏度下降较小。同样，果胶酶添加量为25g/t时，饲料黏度最低（表2）。

表2 木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶最适添加量

木聚糖酶添加量/（g/t） 黏度变化/% 甘露聚糖酶添加量/（g/t） 黏度变化/% 果胶酶添加量/（g/t） 黏度变化/% 0.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0 100.00
99.25
98.50
98.12
97.74
97.74 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 100.00
99.24
99.24
98.48
98.48
98.48 0.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0 100.00
99.37
98.77
98.32
97.87
97.90

2.2 单项酶制剂与复合酶制剂对饲料黏度的效果比较
不同组合酶制剂对饲料的作用效果有显著差异。以饲料黏度为检测指标，饲料中单独添加木聚糖酶或甘露聚糖酶，饲料黏度降低程度远远低于木聚糖酶+甘露聚糖酶和木聚糖酶+甘露聚糖酶+果胶酶这两种组合酶（图1）。
动物日粮中由于原料的组成和含量不同，导致其中NSP的组成和含量也不尽相同，其所需要的NSP酶组成和活性也不同。Malathi和Devegowda（2001）研究表明，因豆粕中富含果胶，在含豆粕高的日粮中添加木聚糖酶、纤维素酶和果胶酶的效果比只添加木聚糖酶和纤维素酶的效果更好。所以，只有根据日粮中NSP的组成和含量，添加相应的NSP酶种类，才能充分挖掘出日粮的营养价值。但是，目前生产中所使用的NSP酶大多标识为“通用复合酶”，其酶谱组合缺乏日粮针对性。因此，在肉鸡（侯小锋，2005）、蛋鸡（赵敏，2006）日粮离体消化能评定方法研究取得成功的基础上，本试验以胃蛋白酶-胰酶两步酶水解法为手段，以食糜黏度变化为评估指标，针对蛋鸡日粮中NSP的特性，筛选与之适应的酶谱，木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶的最适添加量分别为6.0、1.5和25g/t。

图1 不同组合酶制剂对饲料黏度的影响

由于酶制剂的影响因素很多（王继强等，2004），因此，本试验并不能完全证明体外酶解能力的高低与酶制剂在实际生产上的应用效果一致。对于体外酶解试验结果必须结合动物饲养试验才能进行全面的评估，但体外酶解试验结果为酶制剂使用者在筛选时提供了很好的参考。
（参考文献略）