动物胚胎工程应用研究现状与趋势（三）

                                           ——转基因动物
    转基因动物(transgenic animals)就是用实验室方法将人们需要的目的基因导入其基因组，使外源基因与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并能稳定地遗传给后代的动物。整合到动物基因组上的外来结构基因称为转基因，由转基因编码的蛋白质称为转基因产品，通过转基因产品影响动物性状。如果转基因能够遗传给子代，就会形成转基因动物系或群体。转基因哺乳动物自1980年代诞生以来，一直是生命科学研究和讨论的热点，随着研究的不断深入和实验技术的不断完善，转基因技术得到了更广泛的应用，几乎每年都有令人瞩目的研究成果报道，有些转基因成果已经进入实用化和商业化的开发阶段。[1980年，Gordon首次报道用DNA显微注射法获得了转基因小鼠；1982年，美国科学家Palmiter首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵的雄性原核中，获得了转基因小鼠，其个体比对照鼠增大一倍，称之为“超级鼠”。]
    动物转基因主要是将外源基因转移到胚胎细胞内的染色体上，并进行整合、表达和遗传等。动物转基因技术是一项高度综合的技术，它涉及到DNA重组技术、胚胎工程技术和细胞培养技术等，因而这需要多学科的交叉和融合。另外，基因导入细胞的方法有诸多种，如DEAE-葡聚糖转染法、显微注射法、病毒转染法、胚胎干细胞介导法、精子载体法、基因同源重组法、电穿孔转移法等等，这些方法各有自己的特点和优势，但在整个转基因动物生产过程中，其基本原理应该是相同。即将外源基因或体外重组基因经体外增值和修饰转移到动物受精卵或细胞内，或将部分基因剪除或抑制使其在动物体内得以整合和表达，以产生新遗传特征或形状的转基因动物。并能将新的遗传信息稳定地进行世代遗传获得新的转基因系或群体。
    转基因动物的主要技术步骤包括：目的基因的分离与克隆；表达载体的构建；受体细胞的获得；基因导入；受体动物的选择及转基因胚胎的移植；转基因整合表达的检测；转基因动物的性能观测及转基因表达产物的分离与纯化；转基因动物的遗传性能研究以及性能选育；组建转基因动物新类群等。
    目前用于转基因家畜的目标基因主要有三类：以促进生长的生长激素为主(还有促进肌肉发育、促进长毛等)的调控身体组织生长的基因，目的是提高家畜的生产性能；调控机体免疫反应和抗病性的基因，用于提高家畜的抗病力，即抗病育种，如抗猪瘟基因育种中利用阻断猪瘟病毒复制的核酶(ribozyme)基因、抗流感MXI基因工程育种等；编码某些特殊蛋白质的基因，使家畜产生新的性状，把家畜作为一种生物反应器，生产人类所需要的药用蛋白，包括治疗用药物、激素和抗体药物等，而转基因动物生物反应器用于人工合成困难的药物开发具有诱人应用前景。
    动物生物反应器(bioreactor)是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。国际上通常把目的基因在血液循环系统或乳腺中表达的转基因动物称为“动物生物反应器”。其中动物乳腺生物反应器是目前国际上惟一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器[20]。
    动物乳腺有广泛表达外源基因的能力，可以生产各种蛋白质和多肽，从小分子肽到大分子蛋白质，从分泌型蛋白到内膜蛋白、多聚蛋白、二价抗体等，显示动物乳腺是一种很好的生物反应器，在生产高附加值蛋白质方面有广泛用途。用动物乳腺生产重组蛋白质产品还有产品活性高、产量高、产品易于纯化、生产成本低等优势。据专家估计，用细胞培养方法生产1ｇ药物蛋白，成本800～5000美元，而乳腺生物反应器方法只需0.02～0.50美元；传统药物的研制生产周期是15～20年，乳腺生物反应器方法一般为5年。生物反应器技术已成为当今生物工程技术的制高点和市场竞争热点。目前，世界上有数十家公司正在致力于动物生物反应器的研究。估计目前共有20多种转基因动物药品处于临床前研究阶段，主要有三家公司进行：Genzyme Transgenics，PPL Therapeutics，Pharming。据国外经济学家预计，大约2010年之后，转基因动物生产的药品就会鼎足于世界市场，转基因动物生物反应器产业将成为最具有高额利润的新型工业，届时世界上动物乳腺生物反应器的年产值将达到500亿美元[20]，转基因动物-乳腺生物反应器也将是21世纪生物医药产业的一种新的生产模式。
    1987年，美国科学家首先从转基因小鼠的乳汁中获得了治疗急性心肌梗塞最好的溶血栓药物t-PA（组织纤维蛋白溶酶原活化因子）。十多年来，已有数百种产品在小鼠乳腺获得高效表达，其中数种重要医用产品已在大动物乳汁中生产出来，即将投放市场，如山羊乳腺表达抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)、t-PA均达到6 g/L，绵羊乳腺表达抗胰蛋白酶（AAT）达到 35 g/L，家兔乳腺表达葡萄糖苷酶达到10 g/L，猪乳腺表达蛋白Ｃ达到1 g/L、第八因子（F-Ⅷ）达到3 g/L，奶牛乳腺表达乳转铁蛋白达到3.5 g/L[20]。
    动物乳腺可以生产绝大多数蛋白质，但随着细胞大规模培养技术的日趋完善和基因治疗技术的发展，临床上用量较小的细胞因子将不会再用动物乳腺生产，而那些用量很大的产品，如治疗性抗体、血清白蛋白、营养蛋白和工业蛋白将成为动物乳腺生产的主要产品。特别是抗体生产，数年后将占到生物制品的30%～40%，是一项很大的产业。
    作为药用蛋白生产的生物反应器，利用奶山羊和奶绵羊要优于奶牛，其原因如下。首先，奶山羊的产奶量按体重来计算并不比奶牛低。奶山羊的产奶量一般为600-800公斤。因而药用蛋白的产量也不低。如4500只转基因绵羊可生产5000公斤α抗胰蛋白酶，100只转基因山羊可生产100公斤单克隆抗体，75只转基因山羊可生产75公斤ATⅢ（抗凝血酶）。其次，如果采用显微注射的方法生产药用蛋白，奶山羊从最初的显微注射到开始含有药物蛋白的泌乳所需时间是16到18个月（妊娠+生长到性成熟+妊娠），而转基因牛需要25-29个月。由此可见，山羊是生产重组蛋白特别有效的生物反应器，因为它的产奶量相对不低，而投资成本和维持成本都远低于奶牛。现在，转基因山羊和转基因绵羊已经能够生产大量的药用蛋白，也能够从奶中将其提纯和进行生物学测定。有几种产品已经进入临床试验，不久就可进入市场（Meade等人，1999）。例如，转基因山羊生产的ATⅢ已进入Ⅲ期临床试验；转基因山羊生产的t-PA已进入Ⅱ/Ⅲ期临床试验，预计2006年可进入市场；转基因绵羊生产的α抗胰蛋白酶已进入Ⅱ/Ⅲ期临床试验，预计2006年可进入市场。
    我国是从1984年开始转基因动物研究的，并于同年获得了含人β-珠蛋白基因的转基因小鼠。利用显微注射法，1985年和1986年又分别获得了含人生长激素（MT-hGH）基因的转基因泥鳅和小鼠。1987年获得含有大肠杆菌galk和gpt基因的转基因小鼠。以后又相继获得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基因猪、含促红细胞生成素（EPO）和HbgAg 2种基因乳腺特异性表达的转基因山羊、含人凝血因子IX的转基因山羊、含人血清白蛋白基因的转基因奶牛、乳腺表达“生物钢”蛋白基因的转基因老鼠[30]。2003年3月，中国农业大学取得我国首例转基因体细胞克隆牛成功[31]。同年10月，第二头转有人岩藻糖转移酶基因的体细胞克隆牛出生，这标志着我国已经成熟掌握了转基因体细胞克隆牛的技术体系，在该领域的研究跻身世界前列（人民网）。2004年，利用精子载体法制备乳腺生物反应器的转基因兔模型获得成功，该项目由中国军事医学科学院主持，获得F１代转基因兔184只，通过鉴定发现，转基因阳性后代89只，阳性率48.4%（新华网）。
4、胚胎工程技术的综合应用研究技术路线
(一)胚胎体外生产、移植前性别鉴定、胚胎冷冻技术集成
    通过胚胎体外生产、移植前性别鉴定、胚胎冷冻技术的集成，可在体外批量生产已知性别或所需性别的胚胎，胚胎冷冻是使胚胎体外生产更加适于商业化应用的保证和必经只路，因为体外生产胚胎很难安排进